主要采用TaqMan技术,其基本原理是:利用Taq酶5'端外切核酸酶活性,即Taq酶具有天然的5'→3'外切核酸酶活性,能够裂解双链DNA 5'端核苷酸,释放出单个或寡核苷酸,裂解的最佳底物是除置换了的具有叉样结构的单链DNA,水解作用发生于结合了置换部位的磷酸三酯键处。
基于Taq酶的这种活性,设计合成了一个能与PCR产物杂交的寡核苷酸探针,该探针的5’端标记一个荧光分子,3'端标记另一个荧光分子。在两者距离很近且在同一寡核苷酸探针上时,3'端荧光分子能够吸收5'端荧光分子发出的荧光,从而检测不到5'端荧光分子发出的荧光,5'端标记荧光分子称为报告基团,3'端标记的荧光分子成为猝灭基团。但当溶液中有PCR产物(模板)时,该探针与模板退火,即产生了适合于外切核酸酶活性的底物,从而激活Taq酶5'端外切核
酸酶活性,将探针酶5'端连接的荧光分子从探针上切割下来,破坏了两个荧光分子间的FRET,从而发出荧光,切割的荧光分子数与PCR产物的数量成比例。因此,根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
其主要不足是:①采用荧光猝灭及双末端标记技术,猝灭难以彻底,本底较高;②采用外切核酸酶活性,因此定量时受酶性能影响;③探针标记成本较高,不便普及应用。
需要配合试纸使用
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